中间球海胆乳酸脱氢酶基因克隆及其对海水酸化的响应

为明确中间球海胆乳酸脱氢酶(LDH)基因序列及表达特征,研究其对海水酸化胁迫的响应,实验利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得中间球海胆LDH基因(命名为SiLDH)的全长cDNA,并且比较了海水酸化胁迫下,中间球海胆不同组织SiLDH基因表达及总LDH活性的变化情况。结果显示:①SiLDH基因的cDNA全长为1 499 bp,包含133 bp的5′非编码区,349 bp的3′非编码区和1 017 bp编码338个氨基酸的开放阅读框(ORF)。SiLDH编码蛋白的相对分子量为36.40 ku,理论等电点为6.55,属于无信号肽的非跨膜、温和疏水蛋白。②生物信息学分析显示,SiLDH蛋白序列与紫球海胆LDH X4蛋白序列一致性最高(90.88%)。③实时荧光定量PCR(qRT-PCR)发现,SiLDH基因在检测的4种组织中均有表达,相对表达量从高到低为性腺管足肠体腔液;总LDH活性检测显示,中间球海胆总LDH活性从高到低为性腺管足体腔液肠;④海水酸化处理60 d后发现,与自然海水组(pH 8.06±0.01)相比,SiLDH基因在中间球海胆性腺、管足和肠道中呈现总体降低趋势,在体腔液中则呈现随海水pH降低先降低后显著升高的趋势;总LDH活性在性腺、管足和体腔液中呈现随海水pH降低而降低的趋势,在肠道中则呈现随海水pH降低先降低后显著升高的趋势。研究表明,中间球海胆面对海水酸化时可能通过调节SiLDH基因的表达和LDH活性来缓解海水酸化带来的负面影响。     

中间球海胆卵膜与受精膜去除方法及染色体核型分析

去除卵膜及受精膜是成功制备棘皮动物染色体的关键步骤。为找到高效去除海胆卵膜与受精膜的方法,使用三氮唑（2 g/L）、盐酸海水溶液（pH 4.75）、二硫苏糖醇（3×10^-3 mol/L）和对氨基苯甲酸（3×10^-3 mol/L）等4种化学试剂分别对中间球海胆（）卵子及各时期胚胎进行处理,比较了不同试剂、处理时间或处理时期的去膜率、去膜后受精率和胚胎畸形率等指标的差异;利用常规空气干燥法对经去膜处理的囊胚期胚胎制备染色体,并进行核型分析。结果表明,三氮唑、盐酸海水溶液、二硫苏糖醇和对氨基苯甲酸等4种试剂对中间球海胆的卵膜和受精膜均有去除效果,其中2 g/L三氮唑处理未受精卵30 min的去膜率为85.50%,去膜后受精率为97.25%,畸形率为1.75%,去膜效果优于其余处理组。利用经该方法去膜后的早期囊胚进行染色体制备效果较好,获得了61个分散良好、形态完整的染色体中期分裂相。核型分析表明,中间球海胆的二倍体染色体数为2n=42,核型公式为：2n=20m+20sm+2st,NF=84,即有10对中部着丝粒染色体,10对亚中部着丝粒染色体,1对亚端部着丝粒染色体,染色体臂数为NF=84。本研究可为海胆染色体制备及染色体操作育种提供技术参考。     

中间球海胆体腔细胞损失后的恢复规律及恢复期中轴器观察

本研究通过人工抽离中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)体质量10%的体腔液诱导体腔细胞的修复更新,分组测定6、12、18和24 h后海胆围脏腔内的体腔细胞密度,分析体腔细胞的修复规律;同时,取各时间点海胆的中轴器进行组织学观察,并利用鼠抗人Ki-67(细胞增殖抗原)单克隆抗体检测中轴器内的细胞增殖信号。结果显示,人工抽离体腔液后6 h,体腔细胞密度与初始密度相比明显偏低;12 h后逐步升高,密度略低于初始密度,恢复度为(92.78±29.40)%;18 h后已明显高于初始密度,恢复度为(137.08±32.40)%,显著高于6 h和12 h的恢复度(P<0.05),随后,体腔细胞密度逐渐降低。海胆损失体腔液后,中轴器表现为内部组织消减、空腔化,外壁上皮细胞层崩解、脱离,凸起结构空泡化等变化,18 h后内部疏松组织略有增加,24 h后中央腔内出现明显的新生组织。利用Ki-67单克隆抗体检测发现,正常海胆中轴器内具有一定的细胞增殖信号,该信号在损失体腔细胞18 h后明显增强。结果表明,损失体腔细胞后,中间球海胆可启动快速恢复机制,而海胆的中轴器发生明显的组织结构变化,组织内的细胞增殖活动也明显增强。研究结果可为海胆体腔细胞的造血组织与发生机制研究提供依据。     

中间球海胆己糖激酶基因克隆及高温-酸化胁迫对其表达影响的初步研究

为明确中间球海胆己糖激酶的序列信息和表达规律，了解高温-酸化胁迫对其表达和生物活性的影响，以中间球海胆为研究对象，利用cDNA末端快速扩增技术获得中间球海胆已糖激酶基因的全长cDNA序列（SiHK），并利用生物信息学软件分析其序列特征，分析高温-酸化胁迫下中间球海胆肠和性腺组织中SiHK基因的表达及其酶活力变化。结果表明，SiHK基因的cDNA全长2 041 bp，编码476个氨基酸，SiHK蛋白的理论等电点为6.44，蛋白质分子质量52.72 kD。生物信息学分析显示，SiHK蛋白氨基酸序列与紫球海胆HK氨基酸序列相似最高。实时荧光定量PCR结果显示，SiHK基因的表达具有组织特异性，其中，肠和性腺组织中SiHK基因的相对表达量较高，而在体腔液和管足中SiHK酶活力较高。高温-酸化胁迫处理60 d后，与对照组相比，处理组中间球海胆的肠和性腺组织中SiHK基因的相对表达量和SiHK酶活性均发生改变。由此表明，高温-酸化胁迫可能通过调控糖代谢关键酶活性对海胆的物质代谢过程产生影响。     

三种水质调控方式对春秋季刺参池塘水细菌菌群结构的影响

通过16SrRNA高通量测序技术，以自然纳潮和微孔曝气两种水质调控方式池塘为对照，研究了养水机水质调控方式对春秋季刺参养殖池塘水细菌菌群结构的影响。结果表明：各池塘水前10优势门和前3优势纲组成基本一致，但优势属组成差异较大；试验后期（11月份），养水机池塘水与自然纳潮池塘水和微孔曝气池塘水中某些种群丰度具有明显的差异，养水机显著提高了池塘水乳酸菌目的丰度（lefse分析LDA Score＞4），分别提高了251和343倍，显著降低了交替假单胞菌科科和属的丰度（t-test检验），比自然纳潮池塘分别降低了4.1和5.4倍；各池塘水优势功能菌为化能异养12.78%～19.65%和好氧化能异养菌0.96%～4.97%，各功能菌丰度均值差异不显著，但试验后期养水机池塘水发酵菌和植物致病菌丰度增加明显，比自然纳潮池塘和微孔曝气池塘分别提高了32、50和159、216倍；硝酸盐还原菌丰度明显降低，分别降低了4.7和7.7倍；养水机池塘水α-多样性最高，养水机显著提高了池塘水乳酸菌和植物致病菌丰度，提高了细菌种群的α-多样性，前者抑制池塘大型藻生长，后者有益于水质稳定。